Plateforme de phénotypage du poisson zèbre

Plateforme de phénotypage du poisson zèbre

Pour étudier le comportement des larves de poisson zèbre, nous avons modifié et amélioré un automate (la Zebrabox fabriquée par la société ViewPoint) qui permet d’analyser et d’enregistrer le mouvement de larves de poisson zèbre et de programmer différents types de stimuli (lumineux, sonores, électriques). Grâce à ces améliorations (lumière beaucoup plus intense et meilleure sensibilité de la caméra permettant d’analyser le mouvement de larves placées dans des plaques à 96 puits) nous avons développé un test de comportement qui permet de mesurer simultanément l’agitation de plusieurs centaines d’embryons en réponse à l’application d’un stimulus lumineux (PhenoFISH).

Appareil de comportement des larves des poissons zèbres (Zebrabox). Cet appareil mesure la motilité, la distance parcourue par les d’embryons de poissons dans des plaques de 96 puits

Appareil de comportement des larves des poissons zèbres (Zebrabox). Cet appareil mesure la motilité, la distance parcourue par les d’embryons de poissons dans des plaques de 96 puits

Lorsque des embryons non traités et qui ont été préalablement maintenus dans l’obscurité sont soumis à deux flash lumineux intenses de 1 seconde séparés par une période d’obscurité de 10 secondes, ce double stimulus lumineux induit une réponse stéréotypée, mais différente après chacun des deux stimuli. Le premier flash lumineux provoque, après une période de latence d’une à deux secondes, une forte agitation des embryons qui diminue progressivement au cours des 7 à 8 secondes suivantes. En revanche, le deuxième flash n’induit aucune agitation, les embryons sont devenus réfractaires à ce second stimulus.

Activité motrice induite par deux flashs lumineux successifs (flèches noires). Activité des embryons de poissons zèbre en absence de traitement

Activité motrice induite par deux flashs lumineux successifs (flèches noires). Activité des embryons de poissons zèbre en absence de traitement

Ce test simple permet de mettre en évidence et de quantifier des altérations du système musculaire ou du système nerveux des larves. Il permet aussi de mettre en évidence l’activité de molécules psychotropes car la réponse stéréotypée des larves au stimulus lumineux précédemment décrit est altérée d’une manière extrêmement reproductible, et quantifiable par différents types de molécules psycho-actives comme les benzodiazépines ou les inhibiteurs spécifiques de la recapture de la sérotonine (ISRS). Par exemple, dans le cas des benzodiazépines, une classe de molécules utilisées dans le traitement de l’anxiété, de l’insomnie, de l’agitation psychomotrice, ou des spasmes, le traitement des embryons par le diazépam 20 µM diminue considérablement l’intensité de la réponse au premier stimulus tandis que les embryons restent réfractaires au deuxième stimulus.

Effet d’un anxiolytique (Diazepam 20 µM) sur l’activité des embryons de poisson zèbre : la motilité des embryons en réponse au premier flash lumineux est réduite

Effet d’un anxiolytique (Diazepam 20 µM) sur l’activité des embryons de poisson zèbre : la motilité des embryons en réponse au premier flash lumineux est réduite

D’autres modifications de la réponse des larves de poisson zèbre au double stimulus lumineux sont également observées après un traitement avec d’autres molécules comme les cardio-stimulants qui augmentent l’intensité de la réponse des larves au premier flash ou l’apomorphine qui induit un délai de 4 à 6 secondes de la réponse au premier stimulus. On peut ainsi définir un code barre comportemental qui permet d’identifier de nouvelles molécules ayant des activités similaires à celle de composants déjà connus, comme des anxiolytiques, des antidépresseurs ou des agonistes/antagonistes de différents récepteurs.

A l’issue de la mise au point de ce test, nous avons déposé deux brevets[1] et nous avons mis en place une prestation principalement destinée aux entreprises pharmaceutiques et qui permet de réaliser des criblages à grande échelle de molécules psycho-actives in vivo[2]. Nous avons aussi mis au point un logiciel (N° de la licence PCT/EP2012106523)[3] pour analyser les résultats obtenus lors de cribles à grande échelle.

[1] 2011. Soussi-Yanicostas N., Yanicostas C, Alavi-Naini MS.  International patent  (deposit number PCT/EP2012106523). Materials and methods for the treatment of tauopathies. et 2012. Papy-Garcia, D, Huyn, Soussi-Yanicostas N, Vozari R, Sineriz F, Yanicostas C.  European patent (deposit number : 12300005414.0-2107). Method of diagnosis, pronostic or treatment of neurodegenerative diseases.
[2] Soussi-Yanicostas N., Yanicostas C ²High-throughput screening for small psycho-active molecules in zebrafish embryos² (reference : MT0478) INSERM transfert: https://migratech.inserm-transfert.fr
[3] Soussi-Yanicostas N., Blondeel S, Alavi M, Yanicostas C. ²Z software platform for fast mining of large-scale behavioural screening² (reference: MT0577) INSERM transfert: https://migratech.inserm-transfert.fr

 

En plus des outils d’analyse du comportement des larves, la plateforme PhenoFISH offre l’infrastructure et le savoir-faire nécessaires à la production : (1) de poissons aux différents stades du développement qui pourront être une source de protéines ou d’acides nucléiques, (2) d’embryons pour la réalisation d’immunodétections ou d’hybridations in situ, (3) d’embryons morphants (des embryons injectés avec des morpholino-oligonucléotides antisens spécifiques) pour étudier les conséquences de la perte-de-fonction d’un gène d’intérêt, (4) des lignées transgéniques. La plateforme offre aussi la possibilité d’observer et d’analyser le matériel produit (embryons morphants et poissons transgéniques), grâce à des outils d’imagerie performants (loupe binoculaire fluorescente et microscope fluorescent équipé d’un système ApoTome™).

Quelques publications

Sepulveda-Diaz* JE, Alavi Naini* SM, Huynh* MB, Ouidja MO, Yanicostas C, Chantepie S, Villares J, Lamari F, Jospin E, van Kuppevelt TH, Mensah-Nyagan AG, Raisman-Vozari* R, Soussi-Yanicostas* N, Papy-Garcia* D. HS3ST2 expression is critical for the abnormal phosphorylation of tau in Alzheimer’s disease-related tau pathology. Brain. 2015;138(Pt 5):1339-54. *Co-first and last authors.

Ghoumid J, Drevillon L, Alavi-Naini SM, Bondurand N, Rio M, Briand-Suleau A, Nasser M, Goodwin L, Raymond P, Yanicostas C, Goossens M, Lyonnet S, Mowat D, Amiel J, Soussi-Yanicostas N, Giurgea I. ZEB2 zinc-finger missense mutations lead to hypomorphic alleles and a mild Mowat-Wilson syndrome. Hum Mol Genet. 2013, 1;22(13):2652-61.

Yanicostas C, Barbieri E, Hibi M, Brice A, Stevanin G, Soussi-Yanicostas N
Requirement for zebrafish ataxin-7 in differentiation of photoreceptors and cerebellar neurons.
PLoS One. 2012;7(11):e50705.

Martin E, Yanicostas C, Rastetter A, Naini SM, Maouedj A, Kabashi E, Rivaud-Péchoux S, Brice A, Stevanin G, Soussi-Yanicostas N.
Spatacsin and spastizin act in the same pathway required for proper spinal motor neuron axon outgrowth in zebrafish.
Neurobiol Dis. 2012 Dec;48(3):299-308.

Ayari B, El Hachimi KH, Yanicostas C, Landoulsi A, Soussi-Yanicostas N.
Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.
J Neurotrauma. 2010 May; 27(5):959-72.

Yanicostas C, Herbomel E, Dipietromaria A, Soussi-Yanicostas N.
Anosmin-1a is required for fasciculation and terminal targeting of olfactory sensory neuron axons in the zebrafish olfactory system.
Mol Cell Endocrinol. 2009 Nov 27;312(1-2):53-60.

Puverel S, Nakatani H, Parras C, Soussi-Yanicostas N.
Prokineticin receptor 2 expression identifies migrating neuroblasts and their subventricular zone transient-amplifying progenitors in adult mice. J Comp Neurol. 2009 Jan 10;512(2):232-42.